สองพี่น้องกลับมาอีกครั้งในการผจญภัยครั้งใหม่ล่าสุดบนท้องทะเลอันกว้างใหญ่ ออกเรือไปกับ Mario และ Luigi บน Shipshape Island แล้วท่องไปในโลกกว้างของ Concordia พุ่งทะยานออกจากปืนใหญ่ของ Shipshape เพื่อไปเยือน สำรวจ และทำภารกิจบนหมู่เกาะน้อยใหญ่หลากหลาย ตั้งแต่ป่าฝนเขตร้อน ไปจนถึงนครที่คึกคัก ระหว่างทางจะได้พบเพื่อนใหม่อย่าง Connie กับ Snoutlet (ซึ่งไม่ใช่หมูแน่นอน) และจะได้เจอคนคุ้นเคยจาก Mushroom Kingdom อย่าง Peach กับ Bowser ที่อาจมาช่วยเหลือ หรือขัดขวางการเดินทาง พึ่งพาสายสัมพันธ์พี่น้องของ Mario กับ Luigi เพื่อก้าวข้ามทุกสิ่ง ใช้ Bros. Moves ฝ่าสิ่งกีดขวางขณะสำรวจ หรือใช้ Bros. Attacks อันทรงพลังเพื่อคว้าชัยในการต่อสู้รูปแบบเทิร์นเบส ผู้เล่นจะต้องใช้ทุกข้อได้เปรียบซึ่งพี่น้องคู่นี้มอบให้เพื่อฟันฝ่าอุปสรรค